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本试剂盒采用差速离心方法，可以从植物样本中提取到高纯度的类囊体膜样品，本试剂盒为即用型，用户不需要单独配制各种溶液，已经成功用于拟南芥，绿萝，菠菜，豌豆，烟草等植物，还可用于更多植物（可能需要优化条件）。

叶绿体（Chloroplast）是质体的一种，是高等植物和一些藻类所特有的能量转换器，是光合作用的反应场所。在高等植物中叶绿体象双凸或平凸透镜，长径5～10μm，短径2～4μm，厚2～3μm。高等植物的叶肉细胞一般含50～200个叶绿体，可占细胞质的40%，叶绿体的数目因物种细胞类型，生态环境，生理状态而有所不同。叶绿体由叶绿体被膜(chloroplast envelope)、类囊体(thylakoid)和基质(stroma)三部分组成，含有3种不同的膜：外膜、内膜、类囊体膜和3种彼此分开的腔：膜间隙、基质和类囊体腔。类囊体膜上含有光合色素和电子传递链组分，光反应在此上进行，因此类囊体膜也称光合膜。

• 类囊体膜对温度高度敏感，所以整个操作必须在冰上或者在冷室进行，所用器皿和溶液均需要在4℃预冷。
  
• 离心时一定要在4℃进行，离心力以g而不是rpm计算。
  
• 如果需要研究类囊体膜的功能，提取过程还需要在昏暗的光线条件下进行。

• 材料预处理：
  叶片在实验前需先用自来水洗净，再用蒸馏水淋洗，去掉多余水分。如果叶片采集后不能立即处理，则保存时需要保持叶片湿润，即使如此，叶片采集后的放置时间也不能超过一天。
  
• 1×类囊体膜提取缓冲液配制：
  

  成分	用量
  类囊体膜提取缓冲液（5×）	30mL
  BSA	150mg
  1M DTT	150μL
  灭菌水	定容至150mL

  • 冰上预冷待用，现用现配，不建议贮存
    
  • 一个30克样品提取反应需要120mL 1×类囊体膜提取缓冲液。
• 叶片匀浆：
  
  • 新鲜采集植物叶片（约30克），快速去除叶脉并将叶片剪成1-3cm2大小的碎片并浸泡在120mL的预冷的1×类囊体膜提取缓冲液（即用型）中（每克叶片加4mL）。
    
  • 将浸泡了叶片的溶液转移到电动匀浆机（即家用制备果汁的匀浆机，可选货号：RT-2243A）中，低速匀浆5秒，避免起泡沫。用玻璃棒把液面的碎片按入匀浆机底部后，再低速匀浆5秒。注意：除电动匀浆机外，还可以选择玻璃匀浆器和研磨（加玻璃珠）等裂解细胞的方法，但这些方法的单次处理量都比较小，需要将样品分成很多小份单独匀浆，然后再汇集。注：不要用液氮研磨，会损伤类囊体膜；不要过度匀浆，把叶片打碎即可，否则会降低类囊体膜得率。
    
  • 过滤匀浆液：2层过滤纸放于漏斗上，用漏斗将滤液收集到预冷的250mL量筒中，一般分三次收集，总共可收集80～85mL滤液，将滤液等分到4个预冷的50mL的塑料离心管中（每个管中的滤液不要超过35mL）。
• 类囊体膜收集：
  4℃ 4200g离心15分钟，小心弃上清，沉淀即为类囊体膜。
  
• 类囊体膜漂洗：
  
  • 在类囊体膜沉淀中加入1mL预冷的类囊体膜漂洗液，手弹离心管底部使沉淀重悬；再补加1mL预冷的类囊体膜漂洗液，彻底重悬沉淀。
    
    • 重悬时最好避免溶液起泡，手指轻弹，不要用枪头吹打，否则容易损伤类囊体膜。
  • 4℃ 10000g离心2分钟，弃上清，保留沉淀。
• 类囊体膜重悬：
  
  • 沉淀中加入1mL的类囊体膜溶解液，手弹离心管底部使沉淀重悬；再补加1mL预冷的类囊体膜溶解液，彻底重悬沉淀。
    
  • 4℃10000g离心2分钟，上清为可溶性蛋白（根据实验需要保留），沉淀为类囊体膜组分。
    
  • 沉淀中加入1mL类囊体膜溶解液，轻柔重悬沉淀，合并4管溶液，即为最终得到的类囊体膜溶液，约4mL。
• 类囊体膜溶液定量：
  通常类囊体膜蛋白含量用单位叶绿素含量来表示，即x μg叶绿素/ml类囊体膜溶液。
  
  • 取5μL类囊体膜溶液加入到995μL 80%丙酮溶液中，混匀。
    
  • 10000g 4℃离心2分钟，吸取上清，测定OD663和OD646吸光值，用80%丙酮做空白对照。
    
  • 根据以下公式计算叶绿素：
    叶绿素浓度(μg Chl/mL)=200×（17.32×OD₆₄₆+7.18×OD₆₆₃）
    其中，200为稀释倍数。
• 类囊体膜贮存：
  将类囊体膜样品用类囊体膜溶解液稀释到浓度为1mg Chl/ml，根据需要适量分装，如50μL/管，-80℃保存。
  
• 类囊体膜样品溶解和电泳：
  
  • 类囊体膜增溶缓冲液配制：将2.5mL增溶缓冲液（2×）全部加入到增溶剂粉末中，加入灭菌水定容至5mL，彻底混匀，即配成5mL增溶缓冲液，适量分装，-20℃贮存，尽量避免反复冻融。
  • 取50μL(浓度为1mg Chl/ml)类囊体膜样品，4℃ 16000g离心5分钟，弃上清。
    
  • 沉淀中加入50μL类囊体膜增溶缓冲液重悬样品（此时样品浓度为1mg Chl/ml），轻柔混匀，避免产生大量气泡，冰浴10min；4℃ 16000g离心15min；上清为绿色，有微量沉淀。注：如上清为无色，说明增溶不好。
    
  • 取上清移至新管中(大约可以取到45μL上清)，加入1/10体积的类囊体膜上样缓冲液，BN-PAGE 3～12%或4～16%梯度胶电泳（货号：RFT462或RFT463），上样体积5～15μL。